近日，倫敦大學學院Helen C. Hailes教授團隊在《Green Chemistry》上發表了題為“The discovery of new metagenomic urethanases utilising a novel colorimetric assay for applications in the biodegradation of polyurethanes”的研究論文。

該研究基于家庭排水系統宏基因組資源，成功挖掘出三種此前未報道的酰胺酶，并開發了一種基于酪氨酸酶（RsTYR）氧化反應的高通量顏色測定法，可快速篩選具聚氨酯降解能力的酶類。研究結果表明，這些新型酶能有效水解以亞甲基二苯胺（MDA）為骨架的聚氨酯模型底物，并在經過球磨與纖維素酶預處理的商業織物體系中，實現了彈性纖維組分的顯著降解。該研究為聚氨酯及其衍生纖維材料的生物降解與回收提供了新的酶學工具，并提出了可擴展至其他難降解高分子的高效篩選與驗證策略。

研究背景

全球塑料污染問題日益嚴峻，其中紡織品廢棄物年產生量高達9200萬噸，大部分最終被填埋或進入環境。彈性纖維（Spandex）是聚氨酯（PU）類材料的典型代表，其分子結構由芳香族“硬段”（多以4,4'-亞甲基二苯胺MDA為核心）和柔性的聚醚或聚酯“軟段”，這種“軟硬段”嵌段結構賦予材料優異的彈性與韌性，導致其在自然條件下極難降解。與PET等聚酯類塑料相比，聚氨酯的生物降解研究仍處于起步階段，尤其是能斷裂氨基甲酸酯鍵（–NH–COO–）的酰胺酶（urethanase）極為稀少。為此，研究團隊以家庭排水系統這一富含蛋白質殘渣和多樣微生物群的環境為樣本來源，構建宏基因組數據庫，并設計一種酪氨酸酶輔助的顯色測定體系，以實現對潛在聚氨酯水解酶的快速、高通量篩選與驗證。

圖文導讀

圖1 從屬于AS 家族的排水宏基因組中新鑒定的酰胺酶（左）。檢索到的酰胺酶（包括文獻中報道的氨基甲酸酯酶）的單位矩陣百分比和相應的分支圖。

研究團隊利用自建的排水系統宏基因組數據庫（富含蛋白質殘渣與微生物群），通過Pfam數據庫搜索含amidase signature（AS）結構域（PF01425）的開放閱讀框（ORF）。共識別出46條潛在序列，篩選得到9個完整序列并驗證其具備典型的Ser–Ser–Lys催化三聯體（pQR3137–pQR3145）。這些基因被克隆至pET-29a(+)載體中表達，隨后進行系統發育分析。結果顯示，這些新型酶與已報道的UMG-SP系列氨基甲酸酯酶在系統發育樹上形成獨立分支，提示其可能具備新穎的底物識別位點與催化特征。

圖2 (A)彈性纖維模型基質1a-1f  (B)開發 MDA 氧化的 RsTYR 測定法。酶的濃度表示為總重懸浮凍干 CCL 粉末。

研究團隊建立了一種基于MDA釋放與顯色反應的快速檢測體系：酰胺酶水解MDA基模型底物（1a–1f）后釋放出MDA，隨后由RsTYR氧化生成紅色醌類化合物，從而實現酶活的直接顯色檢測。實驗優化后發現，在含 5 mg/mL 細胞裂解液的體系中，RsTYR 能在 18 小時內實現明顯顯色，形成高靈敏度的檢測反應。相比傳統HPLC定量，該方法簡便、重復性高，且可在96孔板中并行操作，適合高通量篩選新型聚氨酯水解酶。

圖 3 使用顏色測定法初篩宏基因組酰胺酶對模型底物（1a-1d）的水解活性，pQR3139, pQR3141, pQR3144顯示陽性（紅色）。

9種候選酶均在E. coli BL21中表達為粗酶液，利用顯色篩選其對模型底物1a–1d的水解活性。結果顯示，pQR3139、pQR3141和pQR3144 三種樣品在反應后均出現顯著紅色變化，表明其具備酰胺酶活性。進一步HPLC定量分析表明，這三種酶可有效水解PEG鏈長度遞增的模型底物，且活性隨PEG鏈長增加而增強, 說明其在疏水性底物識別上具顯著優勢。

表 1 通過HPLC定量三種候選酶對模型底物(1a-1d)的轉化情況及MDA產率

底物1c和1d的水解轉化率為55–69%，生成MDA；1a和1b的轉化率較低（30–38%），產物以單水解中間體為主。結果與比色檢測一致，驗證了顯色體系的準確性與可靠性。研究指出，底物鏈長與柔性程度顯著影響酶的底物適配性。

圖4 與pQR3139、3141和3144進行1cd的時間點反應。使用酶作為CCL，總蛋白濃度為20 mg mL?1，酶含量為10%，反應進行24、48和72小時和1周，重復進行。

以1c和1d為底物，延長反應時間至7天，三種酶均表現出持續的水解能力，生成MDA及中間體（2a–2d）。其中，pQR3144在反應一周后MDA產率最高（65%），表明其穩定性和催化效率優于其他兩種酶。

圖 5 商業織物（粘膠/彈性纖維、棉/彈性纖維）酶法降解工作流程，包括洗滌、球磨、纖維素酶預處理、酰胺酶處理及顏色測定。

為驗證其應用潛力，研究選擇含彈性纖維的商業織物。通過球磨（添加甲醇以增強纖維破碎）及纖維素酶預處理，破壞織物結構、去除纖維素基質，為酰胺酶降解聚氨酯段創造條件。

圖 6 經pQR3139處理后的織物提取液在TYR測定中呈現陽性顯色反應（紅色），表明彈性纖維發生降解。

使用活性最高的pQR3139處理后，織物提取液經RsTYR顯色檢測呈明顯紅橙色，而陰性對照無變化，表明聚氨酯組分被有效降解并釋放出MDA。1H NMR分析進一步檢測到芳香環與甲撐橋信號峰，為降解反應提供直接證據。

主要結論

本研究通過整合宏基因組挖掘、酶學篩選與應用驗證，系統地實現了聚氨酯降解酰胺酶的發現與功能鑒定。研究團隊從家庭排水系統宏基因組中成功挖掘出三種新型酰胺酶（pQR3139、pQR3141、pQR3144），并證實其對MDA型聚氨酯模型底物具有顯著水解活性；同時，開發出基于酪氨酸酶氧化顯色反應的高通量顏色測定法，實現了酰胺酶活性的快速篩選與定性檢測。進一步地，研究在經球磨與纖維素酶預處理的商業織物體系中驗證了這些酶的降解能力，成功實現了聚氨酯彈性纖維的生物降解。該成果不僅拓展了聚氨酯及其他難降解高分子材料的生物降解酶資源庫，也建立了“宏基因組挖掘—酶顯色篩選—實體降解驗證”的一體化研究策略，為未來通過酶工程與代謝途徑優化提升聚氨酯降解效率提供了新方向，并為混合紡織品的分子級循環利用奠定了重要基礎。